https://www.mdu.se/

Med hjälp av molekylärbiologiska tekniker, bland annat nested PCR tekniken, bestämdes och identifierades parasit- och bakteriearter i blodprover från rådjur, älg, dovhjort, kronhjort och vildsvin i Södermanland, Sverige.Total-DNA extraherades ur blodprover, vilka fanns insamlade från jakt i centrala Södermanland. Med hjälp av specifikt designerade primers kördes nested PCR.

Jag koncentrerade mig på den protista paratisen Trypanosoma theileri samt på intracellulära Rickettsia bakterier. PCR reaktionerna analyserades med hjälp av gel elektrofores. Negativa kontroller inkluderades i alla PCR försök för att undvika falska positiva resultat, något som är viktigt vid arbete med nested PCR. Positiva kontroller användes också för att vara säker på att storleker av PCR produkter är rätta.

 För att bestämma protist och bakterie till artnivå krävs att man DNA- sekvenserar de PCR positiva produkterna, det vill säga de DNA-fragment som amplifierats.PCR positiva produkter renades för att bli av med komponenter som till exempel primers eller ospecifika amplifikat som kan störa sekvens reaktionen.

 Sekvenseringsreaktion enligt Sanger utfördes med hjälp av ”cykel-sekvensering”. Därefter precipiterades DNA fragmenten med Etanol/EDTA/natriumacetat och torkades.

Proverna skickades sedan till Karolinska institutet för sekvensbestämning.De erhållna sekvenserna alignerades med programmet ”BLAST”, i NCBI (National Center for Biotechnology Information) därmed kunde de sökta parasit- och bakteriearterna identifieras.